LITOS: una herramienta de iluminación LED versátil para estimulación optogenética

Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 13139 (2022) Citar este artículo

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La optogenética se ha convertido en una herramienta clave para manipular procesos biológicos con alta resolución espacio-temporal. Recientemente, se han desarrollado varios dispositivos de iluminación de pocillos múltiples, comerciales y de código abierto, para proporcionar rendimiento en experimentos de optogenética. Sin embargo, los dispositivos comerciales disponibles siguen siendo costosos y carecen de flexibilidad, mientras que las soluciones de código abierto requieren conocimientos de programación y/o incluyen procesos de ensamblaje complejos. Presentamos una herramienta de iluminación LED para estimulación optogenética (LITOS) basada en una placa de circuito impreso ensamblada que controla una matriz de LED de 32 × 64 disponible comercialmente como fuente de iluminación. LITOS se puede ensamblar rápidamente sin necesidad de soldadura e incluye una interfaz fácil de usar, accesible a través de un sitio web alojado en el propio dispositivo. Se pueden programar fácilmente patrones complejos de estimulación luminosa sin necesidad de conocimientos de codificación. LITOS se puede utilizar con diferentes formatos de placas multipocillos, placas de Petri y matraces. Validamos LITOS midiendo la actividad de la vía de señalización MAPK/ERK en respuesta a diferentes regímenes dinámicos de estimulación lumínica utilizando actuadores optogenéticos FGFR1 y Raf. LITOS puede estimular uniformemente todas las células de un pozo y permite esquemas de estimulación temporal flexibles. La asequibilidad y facilidad de uso de LITOS tienen como objetivo democratizar la optogenética en cualquier laboratorio.

Si bien la optogenética se utilizó por primera vez en neurobiología1, ahora se utiliza ampliamente para controlar una amplia variedad de procesos biológicos celulares con alta resolución espacio-temporal2. Esto ha sido posible gracias al descubrimiento de una serie de dominios proteicos sensibles a la luz que fueron diseñados para construir actuadores que controlen casi cualquier proceso biológico celular2. La precisión de la optogenética para perturbar los sistemas celulares puede conducir a una comprensión más profunda de su regulación dinámica3. Sin embargo, los experimentos optogenéticos también requieren un hardware de estimulación óptica adecuado.

Una configuración experimental optogenética clásica utiliza microscopios ópticos automatizados para estimular las células que expresan actuadores optogenéticos y registrar cualquier producción celular deseada. Cuando se combina con biosensores espectralmente compatibles en un microscopio de fluorescencia, esta configuración puede controlar la entrada celular utilizando el actuador optogenético y registrar la dinámica de salida utilizando el biosensor4. Este ha demostrado ser un enfoque muy potente para estudiar la dinámica de señalización5,6,7. Desafortunadamente, el campo de visión del sistema de lentes del microscopio limita la cantidad de células que reciben la estimulación luminosa. Por lo tanto, los microscopios no pueden estimular suficientes células para medir la producción celular utilizando métodos bioquímicos. Además, el número de patrones de estimulación de entrada diferentes que pueden inducirse en paralelo está restringido. Finalmente, cualquier control optogenético a largo plazo de las células en escalas de tiempo de varios días podría resultar poco práctico o demasiado costoso, especialmente en instalaciones de microscopía.

El uso de una fuente de iluminación dedicada para separar la estimulación del proceso de obtención de imágenes evita algunas de estas limitaciones. Las tiras de LED montadas en una incubadora se pueden usar para estimular un actuador optogenético en una gran cantidad de células, abriendo la posibilidad de medir la producción celular utilizando métodos bioquímicos como Western blot, proteómica o transcriptómica8.

Las configuraciones más avanzadas combinan microcontroladores y fuentes de luz para iluminar específicamente pocillos individuales a partir de placas de varios pocillos. Esto permite estimular múltiples pozos con diferentes patrones de entradas de luz en paralelo, lo que resulta en un mayor rendimiento experimental. Se han desarrollado varias soluciones de hardware que aprovechan los LED como fuentes de iluminación9,10,11,12. Esos dispositivos de código abierto son bastante baratos, pero requieren conocimientos de programación y pueden depender de experiencia en fabricación que no está disponible en la mayoría de los laboratorios. Recientemente, han entrado en el mercado algunos productos comerciales (por ejemplo, LUMOS de AXION Biosystems), pero su coste sigue siendo elevado. En la comunidad optogenética aún falta un dispositivo económico, fácil de ensamblar y fácil de usar que proporcione flexibilidad experimental.

Aquí presentamos una nueva herramienta de iluminación LED para estimulación optogenética (LITOS) para democratizar la optogenética en cualquier laboratorio de biología celular. LITOS permite la estimulación luminosa dinámica de alto rendimiento de grandes poblaciones de células en diferentes formatos de placas multipocillos, placas de Petri o matraces de cultivo celular. Su facilidad de uso permite a los usuarios con pocos conocimientos técnicos y sin habilidades de codificación utilizar fácilmente el dispositivo y configurar patrones de iluminación complejos. Además, LITOS se puede montar fácilmente con herramientas mínimas. Proporcionamos una descripción detallada del ensamblaje de LITOS y documentamos una solución GUI fácil de usar para configurar patrones de iluminación complejos. Validamos LITOS utilizando líneas celulares de mamíferos que expresan actuadores optogenéticos basados en FGFR1 y Raf, y evaluamos la vía de las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPK)/quinasa regulada por señales extracelulares (ERK) como salida de señalización, utilizando enfoques tanto bioquímicos como de imágenes.

Para minimizar la necesidad de procedimientos de fabricación complejos, basamos LITOS completamente en componentes disponibles comercialmente (Figs. 1, 2a). LITOS se basa en una placa de circuito impreso (PCB) personalizada, que se puede solicitar preensamblada a un fabricante de PCB. La PCB actúa como unidad de control para una matriz LED RGB disponible comercialmente. La PCB contiene un microcontrolador ESP32, que proporciona suficiente potencia computacional para controlar la matriz de LED y un nodo de red inalámbrica (Fig. 2b). La matriz de LED RGB consta de una matriz de 32 × 64 LED con un paso de 3 mm que permite la iluminación con cualquier combinación de luz roja, verde y azul. Puede iluminar células cultivadas en placas de 6, 12, 24, 48 o 96 pocillos, así como placas de Petri y matraces de cultivo celular (Fig. 2c). Elegimos este formato de matriz de LED con paso de 3 mm porque se alinea perfectamente con el diseño típico de placa de 96 pocillos (9 mm), lo que da como resultado una matriz de LED de 2 × 2 centrada en cada pocillo. Además, la matriz de LED RGB permite al usuario modular la intensidad de los tres colores a voluntad. Cada uno de los LED individuales produce un cono de luz que ilumina un área que aumenta con la distancia de la muestra al LED. Por lo tanto, al aumentar la distancia entre la muestra y el LED, el campo de iluminación se vuelve progresivamente más homogéneo (Figura complementaria S1a, b). Mostramos que cuando la muestra se coloca a 2 mm de los LED, como es el caso en las 96 placas multipocillos que utilizamos en este estudio, se somete a una iluminación homogénea, con una variación máxima de la intensidad de la luz del 25% en el borde del pozo. Aumentar esta distancia mejora aún más la homogeneidad de la iluminación, sin embargo, a costa de iluminar parcialmente los pocillos vecinos en una placa de 96 pocillos múltiples (Figura complementaria S1a, b). Si bien esto sigue siendo una opción, LITOS no requiere un difusor de luz para mejorar la uniformidad de la iluminación en un pozo, como se usa en dispositivos similares9. Además, la matriz de LED de LITOS permite controlar LED individuales dentro de un pocillo de una placa de 96 pocillos múltiples para crear patrones de iluminación de luz no homogéneos que podrían ser ventajosos en algunos experimentos (Figura complementaria S1c). Al modular la intensidad de los LED individuales, LITOS puede generar gradientes de luz en escalas de cm (Figura complementaria S1d).

Esquemas de los componentes de LITOS. LITOS se compone de dos partes: una placa de circuito impreso (PCB) que actúa como unidad de control y una matriz de LED RGB de 32 × 64 disponible comercialmente. LITOS se puede controlar con un ordenador o un teléfono inteligente a través de una conexión WLAN. La PCB controla la matriz de LED RGB de 32 × 64 para iluminar las células optogenéticas. La matriz LED de densidad densa permite la iluminación de varias placas de cultivo celular y placas de pocillos. Con una pantalla y cuatro botones, LITOS se puede controlar directamente y puede mostrar mensajes sobre la ejecución de un experimento o sobre acciones que requieren la intervención del usuario.

LITOS puede generar patrones de estimulación de luz flexibles. (a) Una vez ensamblado, LITOS se compone de la PCB y la matriz de 32 × 64 LED. Aquí, LITOS se utiliza para generar una matriz de 8 × 12 de 4 LED por pocillo para estimular cada pocillo de una placa de 96 pocillos. (b) La PCB proporciona todo lo necesario para operar la matriz: el microcontrolador con módulo WLAN, las conexiones a la matriz de LED, una pantalla y cuatro botones para acciones definidas por el usuario (por ejemplo, marcar el contorno de una placa, inicio y finalización del experimento). . (c) Ejemplos de aplicaciones LITOS con diferentes formatos de platos o fuentes. Panel izquierdo: estimulación simultánea de dos placas de 96 pocillos, utilizando una máscara de plexiglás opcional para la alineación de las placas. Arriba a la derecha: dos placas de Petri de 100 mm. Abajo a la izquierda: patrón de iluminación alterno para una única placa de 96 pocillos. Abajo a la derecha: patrón de estimulación para una placa de 6 pocillos.

El módulo PCB y la matriz de LED RGB están conectados con un cable plano y un cable de alimentación. Este sencillo procedimiento de montaje no requiere soldadura. Los esquemas de LITOS, así como los de una carcasa impresa en 3D opcional (Figura complementaria S2), se encuentran en nuestra página de GitHub (https://github.com/pertzlab/LITOS).

Para facilitar la alineación de las placas en ambientes oscuros, implementamos 3 soluciones: (i) usar LITOS para mostrar un esquema de referencia de la placa de pocillos deseada en la matriz de LED, que se puede activar directamente mediante un botón en la PCB (Figura complementaria S3a ); (ii) alinear la placa con la esquina superior izquierda de la matriz de LED (Figura complementaria S3b) y (iii) usar una máscara que coloca la placa en la matriz de LED (esta última se puede producir mediante impresión 3D o fresado CNC) ( Figura complementaria S3c). El uso de una máscara de este tipo también permite colocar y estimular dos placas multipocillos en un dispositivo LITOS simultáneamente.

El costo total de LITOS, que comprende una PCB personalizada ensamblada por un fabricante de PCB y una matriz de LED disponible en el mercado, representa aproximadamente USD 200,00. Este bajo precio del dispositivo permite ampliar fácilmente los experimentos pidiendo más unidades. Al pedir varios dispositivos, el precio unitario se puede reducir aún más.

Al igual que el hardware, el software de LITOS fue diseñado para ser fácil de usar. El software presente en la unidad de control utiliza esquemas de iluminación definidos por el usuario, que luego se procesan para controlar la matriz de LED (Fig. 3a-c).

Flujo de trabajo general del usuario de LITOS. (a) Esquema del flujo de trabajo experimental para generar patrones de iluminación específicos. Se puede cargar un archivo csv con el patrón deseado a través de un navegador web en la "Interfaz de configuración" alojada en la unidad de control. Luego, la unidad de control opera la matriz de LED de acuerdo con el patrón de iluminación cargado. (b) Archivo csv de ejemplo utilizado para un patrón de iluminación específico. Aquí, los pozos A01 y B01 están programados para iluminarse cada 5 minutos con un pulso de luz azul de 3 s; Los pocillos C01 y D01 se programan con el mismo patrón pero con un retraso de 30 min. En ambos casos el experimento tiene una duración total de 1 h. (c) La interfaz de usuario alojada por LITOS se utiliza para transferir los patrones de iluminación, que posteriormente se pueden cargar para experimentos de optogenética.

No se necesitan conocimientos de programación para configurar los patrones de iluminación deseados. Para definir qué LED deben encenderse, en qué momento específico, durante qué duración específica y en qué color específico, el usuario crea un archivo de valores separados por comas (csv). Esto se puede hacer utilizando aplicaciones de hojas de cálculo, como Google Sheets, Microsoft Excel o LibreOffice Calc. En el archivo csv, cada línea describe un comando de iluminación (Fig. 3b). Cada columna indica diferentes parámetros del programa de estimulación: LED a activar, hora de inicio de la iluminación, duración de la iluminación, color e intensidad de los LED activos. Para liberar parte de los recursos limitados del microcontrolador para otros procesos de software, limitamos la duración mínima del pulso a 1 s. Otras columnas permiten la generación de bucles para repetir un patrón de estimulación varias veces (por ejemplo, iluminados cada 10 min durante 3 h). Para que el usuario no siempre tenga que definir LED individuales, diseñamos palabras clave para iluminar regiones predefinidas: (i) Pozo (por ejemplo, “A02”/ “A2” para el Pozo A02); (ii) Columna y fila (por ejemplo, “D” para toda la fila D); (iii) placa multipocillos completa (Placa); (iv) matriz completa (Completa); (v) círculo y rectángulos (Rec_start_end). El software de LITOS traduce estas palabras clave en las posiciones de LED correspondientes de la matriz. Para mayor flexibilidad, también es posible controlar LED individuales, permitiendo, por ejemplo, generar gradientes de intensidad y/o color, o la visualización de texto.

Además, dentro de dichos archivos csv, se pueden programar mensajes personalizados con cuentas regresivas para que se muestren en la unidad de control. Esto puede ayudar al usuario con cualquier tarea adicional durante el experimento optogenético, como pipetear un reactivo a un pocillo específico, por ejemplo. Como estas tareas pueden ser urgentes, un pequeño zumbador piezoeléctrico ayuda al usuario con señales auditivas adicionales además de las visuales.

A continuación, el archivo csv del patrón de iluminación se transfiere a la unidad de control a través de su módulo Wi-Fi. Una interfaz de configuración basada en JavaScript (Fig. 3c) está alojada en la unidad de control para cargar y administrar patrones de iluminación, cambiar configuraciones y preparar LITOS para un experimento. Se pueden almacenar múltiples patrones de iluminación en la memoria interna de la unidad de control, lo que permite reutilizar patrones de estimulación sin necesidad de volver a cargarlos. Se puede acceder a la interfaz de configuración de la unidad de control a través de un punto de acceso WLAN creado por LITOS o a través de la red Wi-Fi local. La información necesaria para la conexión, como la dirección IP de LITOS o el nombre del punto de acceso WLAN creado, se muestra en la pantalla interna. Cuando está conectado, el usuario puede acceder a la interfaz de configuración desde un navegador web en cualquier computadora o teléfono inteligente independientemente de la plataforma.

Una vez que se transfiere y selecciona un patrón de iluminación, LITOS está listo para realizar el experimento. Los botones LITOS permiten al usuario navegar por el menú, iniciar o cancelar el experimento, o indicar con un contorno en la matriz RGB dónde colocar la placa de múltiples pocillos. El progreso actual de un programa de iluminación en LITOS se puede monitorear directamente en la pantalla de la unidad de control. La película complementaria S1 muestra la matriz de LED aplicando un patrón de estimulación en el que cada columna de una placa de 96 pocillos se ilumina secuencialmente.

Mientras realizábamos experimentos iniciales, descubrimos que la matriz de LED desarrollaba un calor que posiblemente podría ser perjudicial para la salud celular. Descubrimos que la matriz de LED se calienta incluso en estado inactivo cuando no se produce estimulación luminosa. Para resolver este problema, integramos un circuito que utiliza transistores de efecto de campo semiconductores de óxido metálico (MOSFET) N y P en la unidad de control de LITOS para entregar corriente eléctrica a la matriz solo cuando se requiere un proceso de iluminación. Esto redujo el desarrollo de calor observado para patrones de estimulación repetitivos. Luego evaluamos el cambio en la temperatura del medio debido a la iluminación de LITOS midiendo la temperatura del medio después de diferentes patrones de estimulación. Como era de esperar, nuestras medidas muestran que una estimulación lumínica más prolongada y frecuente provocó un mayor aumento de temperatura, que alcanzó una meseta después de aproximadamente 1 h (Figura complementaria S4). Sin embargo, los experimentos mostrados en este artículo nunca requirieron esquemas de estimulación lumínica que produjeran suficiente calor como para comprometer la salud celular. En caso de que los experimentos requieran entradas de luz sostenidas durante mucho tiempo, agregar pequeños disipadores de calor pasivos podría reducir el sobrecalentamiento. Otro enfoque es diseñar el módulo optogenético con un koff bajo para provocar interacciones sostenidas dependientes de la luz. Por ejemplo, en el sistema iLID (dímero mejorado inducible por luz), las afinidades y la vida útil de la interacción dependiente de la luz pueden diseñarse mediante diversas mutaciones13.

LITOS se presta a un amplio espectro de aplicaciones optogenéticas y sistemas modelo. Para demostrar la flexibilidad y versatilidad de LITOS, realizamos experimentos optogenéticos para estudiar la vía MAPK/ERK. La red MAPK es capaz de decodificar una variedad de señales extracelulares e intracelulares, para convertirlas en decisiones de destino específicas, y desempeña papeles fundamentales tanto en fisiología como en patología14. Por este motivo, se han desarrollado múltiples actuadores optogenéticos y biosensores fluorescentes para controlar y medir diferentes nodos de señalización de esta vía, lo que lo convierte en un sistema modelo ideal para exhibir LITOS.

Utilizamos fibroblastos NIH3T3 de ratón y líneas celulares epiteliales mamarias MCF10A, diseñadas para expresar de manera estable un circuito codificado genéticamente que consiste en un actuador optogenético para activar diferentes nodos en la red MAPK y un biosensor fluorescente para registrar la dinámica de la salida de señalización ERK. Este circuito consta de un receptor optogenético del factor de crecimiento de fibroblastos (optoFGFR), que consiste en un dominio intracelular miristoilado del receptor 1 del factor de crecimiento de fibroblastos fusionado con el dominio sensible a la luz CRY2 que, tras la estimulación con luz azul, se multimeriza, se autofosforila y activa la vía MAPK4. . Luego, la salida de señalización de ERK se puede medir utilizando un indicador de translocación de quinasa ERK (KTR) que informa sobre la actividad de ERK con resolución unicelular15. Para ser espectralmente compatible con la activación optogenética, ERK-KTR se fusiona con una proteína fluorescente roja mRuby2 que puede excitarse sin activar optoFGFR. Además, ambas líneas celulares expresan de manera estable un marcador nuclear de histona H2B fusionado a la proteína fluorescente de color rojo lejano miRFP703 (H2B-miRFP703). En la Fig. 4a se muestra un esquema de este circuito genético. Luego utilizamos un enfoque de visión por computadora para inferir el estado de activación de ERK para cada celda (Fig. 4b). Para ello, los núcleos se segmentaron automáticamente utilizando el canal H2B-miRFP703 y se utilizaron para derivar una máscara nuclear y una máscara de anillo citosólico alrededor del núcleo. Luego, se calcula una relación de las intensidades de fluorescencia medianas del canal ERK-KTR-mRuby2 utilizando las máscaras citosólica y nuclear como un indicador de la actividad de ERK (relación C/N)16.

LITOS en el estudio de la dinámica de señalización de la vía MAPK. (a) Tras la estimulación de optoFGFR, la vía MAPK se activa, lo que lleva a la fosforilación y posterior activación de ERK. La ERK activa fosforila ERK-KTR, lo que lleva a su translocación reversible al citosol. (b) Canal de visión por computadora para análisis de imágenes. La segmentación nuclear de células NIH3T3 (rojo), basada en el marcador nuclear H2B, y su expansión en forma de anillo (azul) se utilizan para medir la relación entre el citosol y el núcleo (C/N) de ERK-KTR. Una relación C/N alta corresponde a una actividad ERK alta. (c) La fila superior representa la relación C/N ERK-KTR codificada por colores de todas las células NIH3T3 en pocillos de 6,38 mm de diámetro (placa de 96 pocillos). Las dos filas inferiores representan un ejemplo de resolución completa de un FOV que compone la imagen más grande de arriba, con H2B-miRFP703 y ERK-KTR-mRuby2 mostrados en escala de grises invertida. (d) Las células MCF10A que expresan ERK-KTR se estimularon con un pulso de luz de 10 s de duración, se fijaron con paraformaldehído al 4% y su actividad ERK se cuantificó como se muestra en (b). Luego se comparó la actividad de ERK con una transferencia Western contra ERK fosforilada y total de las mismas células (abajo). Las transferencias Western nativas no recortadas están disponibles en la figura complementaria S4.

La primera característica de LITOS que evaluamos fue la capacidad de la matriz de LED para estimular de manera homogénea todas las células dentro de un pocillo. Esta característica es crucial para aplicaciones para toda la población. Para ello, estimulamos placas de 96 pocillos, en las que cada pocillo está iluminado por cuatro LED, y medimos ERK-KTR C/N en todas las celdas de un pocillo adquiriendo una gran imagen en mosaico de cada pocillo completo. La visualización de los valores de la relación C/N de ERK-KTR de cada célula en pocillos enteros reveló que los cuatro LED de un solo pocillo indujeron una activación optogenética robusta y homogénea de la vía MAPK (Fig. 4c). Debido a que los diferentes experimentos se realizaron en pozos adyacentes, esto también muestra que la pequeña cantidad de luz que se desborda no conduce a la activación de la actividad ERK.

Luego probamos la capacidad de LITOS para generar una activación robusta de ERK con un método bioquímico promedio de la población, mediante el uso de análisis de transferencia Western con un anticuerpo fosfoERK (pERK). Para producir suficiente lisado de proteínas, sembramos células MCF10A en placas de 6 pocillos, produciendo aproximadamente 250 µg de lisado de proteínas por pocillo. La iluminación de un pocillo completo de una placa de 6 pocillos requirió encender 112 LED (Fig. 2c, panel inferior derecho). Estimulamos las células que expresan optoFGFR usando un pulso de luz azul de 10 s con LITOS y fijamos las células usando paraformaldehído en diferentes puntos de tiempo con un intervalo de 3 minutos. Para comparar la dinámica de activación de ERK observada mediante Western blot versus el biosensor ERK-KTR, medimos la relación C/N de ERK-KTR en todos los pocillos antes de la extracción de proteínas. Para promediar cualquier variabilidad local de las relaciones C/N de ERK-KTR unicelular, tomamos muestras de cada pocillo con 16 FOV y calculamos el promedio de su población. La medición de Western blot de pERK endógena sigue de cerca la medición de la actividad de la quinasa ERK utilizando el biosensor ERK-KTR. De acuerdo con observaciones previas5,16, tanto las señales pERK como ERK-KTR mostraron un fuerte aumento en la actividad de ERK directamente después de la estimulación luminosa, seguido de una adaptación más lenta, que conduce a niveles de actividad de ERK previos a la estimulación en 20 minutos apropiados. La señal ERK-KTR (pico a los 6 min) se retrasó ligeramente en comparación con la señal pERK (pico a los 3 min) (Fig. 4d). Esto podría reflejar el tiempo que ERK necesita para trasladarse al núcleo y/o el tiempo que el biosensor ERK-KTR necesita para trasladarse al citosol.

Estos experimentos muestran que LITOS puede activar de manera uniforme y confiable todas las células en un pozo grande y demuestran que puede estimular la gran cantidad de células necesarias para la transferencia Western. Esto hace que LITOS también sea compatible con otras mediciones promedio de la población (por ejemplo, transcriptómica o (fosfo)proteómica).

Para aprovechar al máximo el potencial de la optogenética en el control de procesos biológicos dinámicos, LITOS debería ser capaz de activar diferentes actuadores optogenéticos, además de tener una gran flexibilidad a la hora de crear patrones de iluminación complejos. Por lo tanto, realizamos una serie de experimentos adicionales para demostrar que LITOS cumple con estos requisitos. En todos los experimentos siguientes, programamos LITOS para aplicar automáticamente las entradas de luz a diferentes pocillos en momentos específicos, de modo que las células en una placa de 96 pocillos se puedan fijar simultáneamente al final del experimento. Después de la fijación celular, tomamos imágenes de todos los pocillos de las placas mediante microscopía automatizada. Luego aprovechamos nuestro proceso de análisis de imágenes automatizado para calcular una actividad ERK media por pozo. Tenga en cuenta que realizar tales experimentos con pipeteo de factores de crecimiento para activar la red MAPK de manera resuelta en el tiempo sería muy laborioso.

Primero evaluamos si LITOS también es capaz de estimular un actuador optogenético que utiliza un mecanismo de activación diferente al del optoFGFR. A diferencia del optoFGFR, que se basa en la multimerización de un receptor de membrana sensible a la luz, optoRaf17 implica el reclutamiento dependiente de la luz de un dominio catalítico c-Raf en la membrana a través de un sistema CRY2. Para evaluar si LITOS también puede estimular optoRaf, analizamos entradas de luz de diferentes duraciones y las comparamos con la estimulación optoFGFR. Observamos que un pulso de luz de 30 s indujo una mayor amplitud de ERK en el sistema optoRaf versus el sistema optoFGFR (Fig. 5a). Esto también fue evidente en momentos posteriores. En respuesta al aumento de la entrada de luz, optoFGFR condujo a una transición de una dinámica ERK transitoria a una sostenida, como se observó anteriormente5, mientras que optoRaf siempre mostró una dinámica ERK adaptativa. Las diferentes dinámicas de ERK inducidas por las entradas de optoFGFR y optoRaf podrían reflejar diferentes mecanismos de actuación o una diferencia en la capacidad de los dos actuadores para activar ERK desde diferentes niveles dentro de la red MAPK: optoFGFR desencadena la activación de una red MAPK completa aguas abajo de la receptor, mientras que optoRaf solo desencadena la activación de una red MEK/ERK aislada. Esto ilustra cómo se puede utilizar LITOS para estudiar la dinámica de ERK inducida por diferentes actuadores optogenéticos.

Mostrando la versatilidad de LITOS en el estudio de la dinámica de señalización MAPK. (a) Respuesta de ERK a entradas de luz optoFGFR u optoRaf en diferentes momentos. (b) Pequeña prueba de detección de fármacos en NIH3T3 que expresa optoFGFR realizada en una sola placa de 96 pocillos utilizando diferentes concentraciones del inhibidor de Raf RAF709, el inhibidor de ERK SCH772984 y el inhibidor de MEK U0126. (c) Dinámica de la actividad de ERK medida después de un único pulso de luz azul de 2 s de duración con LITOS medido con una resolución temporal de 1 min. (d) Comparación de la dinámica de actividad ERK pulsátil y sostenida generada con LITOS. ( a – d ) La actividad de ERK se midió como ERK-KTR C / N. Los diagramas de caja representan la mediana (línea central), el segundo y tercer cuartil (cajas) y el rango intercuartil de 1,5 (bigotes) de mediciones de C/N de ERK-KTR unicelulares. Los gráficos de líneas representan el promedio (línea) y el error estándar del intervalo medio (barras de error) de mediciones de C/N de ERK-KTR de una sola celda.

Luego evaluamos más a fondo el potencial de LITOS para realizar una detección de drogas con la dinámica ERK como lectura (Fig. 5b). Como prueba de concepto, probamos 3 fármacos que inhiben la vía MAPK: el inhibidor de Raf RAF709, el inhibidor de MEK U0126 y el inhibidor de ERK SCH772984. Aplicamos cada inhibidor en 2 concentraciones. Estimulamos células optoFGFR con un solo pulso de luz azul de 10 s en presencia de los inhibidores y medimos la actividad de ERK en 12 puntos de tiempo diferentes con una resolución de tiempo de 2 minutos. Los tres fármacos condujeron a una reducción dosis-dependiente de la actividad de ERK. El pico de actividad de ERK se redujo notablemente con las dos concentraciones más altas de RAF709 y U0126, o incluso se anuló con la concentración más alta de SCH772984 (Fig. 5b). Esto muestra que LITOS es adecuado para detectar perturbaciones de la dinámica de señalización con relativamente poco esfuerzo.

A continuación, evaluamos el potencial de LITOS para estudiar la dinámica de ERK que requiere alta resolución temporal. Para este propósito, estimulamos las células optoFGFR con un solo pulso de luz azul de 2 s y fijamos las células con una resolución de tiempo de 1 min. Esto capturó detalles altamente resueltos de la dinámica de la actividad de ERK, como la fase pronunciada de activación de ERK seguida de una fase más lenta de adaptación (Fig. 5c). Este resultado enfatiza la capacidad de LITOS para estudiar eventos de señalización rápida.

Los experimentos que hemos documentado hasta ahora se basan en pulsos únicos de luz azul. Sin embargo, se sabe que diferentes redes de señalización codifican diferentes patrones de señalización dinámica que pueden consistir en dinámicas de señalización transitorias, sostenidas, oscilatorias o pulsátiles18. Reproducir estos perfiles dinámicos complejos utilizando un enfoque de biología sintética podría proporcionar información clave sobre la red que da forma a estas dinámicas. Por lo tanto, evaluamos la capacidad de LITOS para producir patrones de entrada de luz más complejos para evocar patrones dinámicos sintéticos de ERK específicos. Para hacerlo, programamos LITOS para estimular células optoFGFR con pulsos de luz de frecuencia alta (cada 2 min) o baja (cada 20 min) de 10 s de duración durante un total de 84 min. Descubrimos que los pulsos de luz de alta frecuencia evocan una dinámica ERK sostenida (Fig. 5d). Esto es consistente con el hallazgo de que un solo pulso de luz azul enciende el optoFGFR durante aproximadamente 5 a 10 minutos, por lo que no permite que ERK se desactive si el optoFGFR se reactiva cada 2 minutos. Por el contrario, los pulsos de luz de baja frecuencia evocaron pulsos ERK sucesivos y discretos que mostraron adaptación a la línea de base hasta que se aplicó una nueva entrada de luz. Esto muestra cómo se puede utilizar LITOS para ajustar con precisión la dinámica ERK sintética definida por el usuario. Este experimento requirió la aplicación de diferentes esquemas de estimulación lumínica a 86 pocillos de la placa de pocillos (esquemas de estimulación en las figuras complementarias S6 y S7), lo que ilustra la complejidad de los experimentos que LITOS puede abordar. LITOS proporcionó la resolución temporal para capturar una disminución transitoria en la fosforilación de ERK-KTR (Fig. 5b, d) que previamente hemos demostrado que resulta de la activación de optoFGFR-calcineurina5. En conjunto, estos resultados muestran que LITOS es un dispositivo optogenético altamente flexible que permite realizar experimentos complejos para estudiar la dinámica de la vía MAPK.

Presentamos LITOS, una herramienta de matriz LED robusta, fácil de usar, económica y fácil de montar con el objetivo de democratizar los experimentos de estimulación optogenética basados en incubadoras. LITOS se compone de piezas que se pueden comprar fácilmente en línea o pedir al fabricante. Aquí y en un repositorio de GitHub (https://github.com/pertzlab/LITOS), proporcionamos instrucciones para ensamblar y usar LITOS. También documentamos una solución de software dedicada para controlar LITOS. Comparamos LITOS mediante el estudio de la vía de señalización dinámica MAPK, que puede ser manipulada por diferentes actuadores optogenéticos y medida utilizando un biosensor fluorescente. Esto demostró que la densidad de LED en LITOS es suficiente para estimular uniformemente todas las células cultivadas en placas de pocillos (Fig. 4c), lo que permite realizar mediciones confiables del promedio de la población utilizando métodos bioquímicos como la transferencia Western (Fig. 4d). Además, demostramos que LITOS es compatible con dos actuadores optogenéticos diferentes (Fig. 5a), proporciona el rendimiento necesario para realizar pruebas de detección de medicamentos pequeñas (Fig. 5b), permite mediciones de alta resolución temporal (Fig. 5c) y permite la aplicación de esquemas complejos de estimulación lumínica (Fig. 5d). Estas características satisfacen las necesidades del campo de la optogenética en rápida expansión y su aplicación en el estudio de procesos dinámicos.

La importancia de la regulación dinámica de los procesos biológicos, incluida la dinámica de señalización, ha sido cada vez más reconocida en los últimos años18. La dinámica pulsátil de la actividad ERK observada en colectivos epiteliales es uno de los ejemplos más llamativos16,17,19,20,21,22. En este caso, se ha demostrado que la frecuencia de los pulsos ERK de amplitud y duración constantes controla diferentes decisiones sobre el destino, como la muerte celular, la supervivencia, la proliferación y la migración16,19,21,22. Los biosensores fluorescentes nos han permitido visualizar estos eventos de señalización en escalas espaciales y temporales adecuadas. La optogenética ahora también nos permite controlar estos procesos biológicos en estas escalas temporales y espaciales biológicamente relevantes de una manera no invasiva. Anteriormente habíamos demostrado que la aplicación de entradas optoFGFR u optoRaf moduladas en frecuencia puede evocar regímenes dinámicos ERK modulados en frecuencia en los que todas las células de la población responden sincrónicamente16. Esto contrasta con la aplicación masiva sostenida de factores de crecimiento comúnmente utilizada que a menudo conduce a comportamientos de señalización heterogéneos y no sincronizados16,19,23. Aquí, LITOS revela nuevamente que esto ocurre cuando se aplican entradas optoFGFR específicas mediadas por luz. La aplicación de una entrada de optoFGFR mediada por luz con LITOS condujo a una activación pronunciada de ERK homogénea en la población seguida de una adaptación, lo que llevó a todas las células de una población a experimentar un pulso de ERK idéntico (Fig. 4c). Múltiples pulsos de luz, aplicados a baja frecuencia, podrían conducir a pulsos ERK discretos sincrónicos en la población (Fig. 5d). Por el contrario, cuando esos pulsos de luz se aplicaron a alta frecuencia, lo que no permitió la inactivación del optoFGFR5, se pudo provocar una actividad sostenida de ERK (Fig. 5d). Prevemos que estas características de LITOS, así como de dispositivos similares, aumentarán la confiabilidad de las mediciones bioquímicas promedio de la población, como la transferencia Western, la transcriptómica o la (fosfo)proteómica. Aquí, la capacidad de inducir dinámicas ERK sincrónicas de la población proporcionará mediciones confiables del promedio de la población utilizando enfoques bioquímicos. Esto contrasta con los experimentos de estimulación masiva del factor de crecimiento que podrían promediar estados de señalización heterogéneos. Por ejemplo, imaginamos que los fosfoproteomas altamente resueltos temporalmente de un pulso ERK evocados por una entrada transitoria de optoFGFR podrían mapear las fluctuaciones de los fosfositos en escalas de tiempo biológicamente relevantes, proporcionando una mejor comprensión de la señalización del receptor tirosina quinasa-MAPK. Alternativamente, la capacidad de evocar dinámicas ERK sintéticas deseadas que pueden inducir decisiones de destino específicas (p. ej., supervivencia, proliferación, diferenciación), cuando se combinan con enfoques ómicos (p. ej., transcriptómica, (fosfo)proteómica) podría proporcionar nuevos conocimientos sobre cómo se desarrollan las dinámicas ERK. decodificado en decisiones de destino. Aprovechando el repertorio en constante expansión de biosensores y actuadores optogenéticos, imaginamos que se puede aplicar una lógica experimental similar a otros sistemas de señalización.

Otro potencial importante de LITOS está en el estudio de procesos biológicos que ocurren en escalas de tiempo durante varios días y que requerirían microscopios dedicados durante grandes períodos de tiempo para la estimulación optogenética. Esto se ilustra en un estudio separado en el que utilizamos LITOS para controlar optogenéticamente la señalización de ERK en la morfogénesis de los acinos mamarios en 3D, un proceso de desarrollo que se desarrolla durante un período de 2 semanas24. Nos centramos en un episodio de desarrollo dependiente de ERK en el que la luz acinar se forma mediante la supervivencia de las células externas y la apoptosis de la masa celular interna en un proceso que dura aproximadamente una semana. Descubrimos que la frecuencia del pulso de ERK era mayor en las células externas que en las internas y planteamos la hipótesis de que, por lo tanto, la frecuencia del pulso de ERK dicta el destino de la supervivencia frente a la apoptosis. Utilizando actuadores optoFGFR y optoRaf, utilizamos LITOS para evocar diferentes regímenes de pulsos ERK sintéticos modulados en frecuencia. Observamos que los regímenes de pulsos ERK de alta frecuencia rescataron los fenotipos de supervivencia en las células internas, dificultando la formación de la luz de los acinos. Estos resultados ilustran cómo LITOS puede controlar eventos morfogenéticos que ocurren en varios días en experimentos realizados dentro de una incubadora de cultivo de tejidos. Prevemos que el control de actuadores optogenéticos mediado por LITOS podría usarse para una amplia gama de aplicaciones en biología 3D, incluido el cultivo de organoides.

El diseño simple de LITOS lo hace versátil y asequible. Si bien restringimos nuestro estudio a sistemas basados en CRY2, la matriz LED RGB de LITOS también debería permitir el control de actuadores optogenéticos basados en dominios criptocromo, dronpa y LOV (p. ej., iLID, TULIP)25. Sin embargo, la simplicidad de LITOS también puede tener algunas limitaciones. La densidad de potencia máxima se encuentra en el extremo inferior del rango con respecto a otros dispositivos comerciales y de código abierto (Tabla complementaria S1). Recomendamos a los nuevos usuarios que prueben si su sistema optogenético favorito puede activarse mediante la intensidad de la luz producida por LITOS. Además, LITOS no es espectralmente compatible con actuadores basados en fitocromo que requieren luz infrarroja. Sin embargo, prevemos que en el futuro estarán disponibles nuevos actuadores optogenéticos que se puedan activar con longitudes de onda adicionales26 y ampliarán el rango de aplicación de LITOS.

En resumen, desarrollamos y probamos LITOS, un dispositivo de iluminación LED para optogenética económico, robusto y fácil de usar. Hemos ilustrado cómo se podría utilizar LITOS en el estudio de la señalización MAPK. Prevemos una amplia gama de aplicaciones para LITOS fuera del campo de la señalización. Por ejemplo, podría aplicarse para estudiar la expresión genética controlada por luz en bacterias27, la investigación de biología del desarrollo en Drosophila28 o para la edición del genoma fotoactivable CRISPR-Cas929.

Más información sobre LITOS, cómo pedir uno y su código de fuente abierta están disponibles en el siguiente repositorio de GitHub (https://github.com/pertzlab/LITOS).

LITOS consta de una matriz de LED RGB disponible comercialmente (módulo de pantalla LED para interiores P3, 32 × 64 píxeles, con IC FM6126A, de Shenzhen Xuyang Technology Co. Ltd., aunque también se podrían utilizar potencialmente módulos con otros IC) para la estimulación celular. y una placa de circuito impreso (PCB) personalizada. Las emisiones máximas del LED de matriz RGB son de 620 a 630 nm para el rojo, de 520 a 525 nm para el verde y de 465 a 470 nm para el azul. Para cada LED se pueden configurar 256 niveles de intensidad con una densidad de potencia máxima para el LED azul de 135 ± 0,11 µW/cm2. La PCB está construida alrededor del módulo ESP32-WROOM (Espressif Systems Shanghai Co. Ltd.) y actúa como unidad de control para la matriz de LED. Además de los circuitos necesarios para esta tarea, un módulo de pantalla OLED de 1,5 pulgadas (con IC de control SSD1351) y un timbre (AI-1223-TWT-3 V-2-R, audio PUI) brindan posibilidades de salida audiovisual adicionales. Los botones de control (B3F-4050, Omron) se utilizan para la entrada del usuario. La programación inicial se puede realizar mediante el puente UART serie USB agregado (231-XS, FTDI). La alimentación se suministra mediante un adaptador de corriente de pared externo de 5 V, conectado a un conector jack cilíndrico de 2,1 mm × 5,5 mm colocado en la PCB. Como hay componentes que requieren un voltaje menor de 3,3 V, se agregó al PCB un regulador de voltaje lineal (LM1117, Texas Instruments). El diagrama del circuito de LITOS, los archivos de diseño de PCB (generados con KiCad 6.01, https://www.kicad.org/) y su lista de materiales se pueden encontrar en nuestro repositorio de GitHub (https://github.com/pertzlab/LITOS) .

El PCB se conecta a la matriz de LED RGB con un cable que proporciona la energía requerida y con un cable plano de 16 pines que se utiliza para la transmisión de señal. Ambos cables se conectan a la PCB y a la matriz de LED RGB a través de cabezales existentes. Finalmente, la PCB se conecta a la fuente de alimentación externa de 5 V. Además, la PCB se puede conectar a una computadora mediante un cable USB. Esto es necesario para cargar inicialmente el software de LITOS en el microcontrolador ESP32 (si no lo ha cargado el fabricante de la PCB). Después de eso, la conexión a una computadora se establece a través de Wi-Fi.

Para medir el campo de iluminación, expusimos papel fotográfico (Ilford Multigrade RC DeLuxe 44 M perla) a 1 s de luz azul producida por LITOS a diferentes intensidades, como se especifica en la leyenda. Colocamos el papel fotográfico sobre un portaobjetos de vidrio de 0,17 mm a varias distancias de la matriz de LED utilizando exposiciones idénticas. Después de exponer el papel fotográfico a luz azul, lo revelamos durante 1 min. Las fotografías de los campos de iluminación fueron escaneadas en escala de grises con una resolución de 400 ppp. Los perfiles de intensidad de los campos de iluminación se produjeron con ImageJ 1.53.

El ESP32, ubicado en la PCB, se programa en C/C++ utilizando la capa de abstracción de hardware Arduino. La interfaz de configuración está programada en Vue, un marco web progresivo para crear la interfaz de configuración como aplicaciones de una sola página (https://vuejs.org/). El código fuente se puede encontrar en nuestro repositorio de GitHub (https://github.com/pertzlab/LITOS).

La línea celular de fibroblastos embrionarios de ratón NIH3T3 fue un regalo de T. Hunter, del Instituto Salk de Estudios Biológicos en La Jolla, California. La línea celular epitelial mamaria humana no tumorigénica MCF10A fue un regalo de JS Brugge, de la Facultad de Medicina de Harvard, Boston, MA. Mantuvimos células NIH3T3 en glucosa media-alta (DMEM) de Eagle modificada por Dulbecco de Sigma-Aldrich (Ref: D5671) suplementada con suero bovino fetal (FBS) al 10%, penicilina 200 U/ml y estreptomicina 200 µg/ml y l 200 nM. -glutamina. Antes del pase, la confluencia se mantuvo por debajo del 40-50% para evitar cambios en el comportamiento de las células NIH3T3. Las células MCF10A se mantuvieron en DMEM:F12 (D8437) de Sigma-Aldrich suplementado con suero de caballo al 5%, penicilina 200 U/ml y estreptomicina 200 µg/ml, EGF 20 ng/ml (Peprotech), insulina 10 µg/ml ( Sigma-Aldrich/Merck) y 0,5 µg/ml de Hidrocortisona (Sigma-Aldrich/Merck).

Las células NIH3T3 y MCF10A se privaron de alimento en un medio que consistía en una mezcla de nutrientes F-12 de Ham (Sigma N4888) con 200 U/ml de penicilina y 200 µg/ml de estreptomicina y L-glutamina 200 nM y albúmina sérica bovina al 0,5 % para las células NIH3T3 y DMEM:F12 (Sigma D8437) suplementado con 0,3 % de BSA, 0,5 µg/ml de hidrocortisona y 200 U/ml de penicilina y 200 µg/ml de estreptomicina para células MCF10A. Las células NIH3T3 y MCF10A se modificaron de forma estable para expresar optoFGFR (fusionado con una proteína fluorescente mCitrine) u optoRAF (fusionado también con una proteína fluorescente mCitrine). OptoFGFR se transdujo mediante un vector lentiviral (Lyn-cytoFGFR1-PHR-mCit) y optoRAF mediante un plásmido PiggyBac (pPB3.0.PURO.CRY2.cRAF.mCitrine.P2A.CIBN.KrasCT). Ambos sistemas expresan resistencia a la puromicina que utilizamos para seleccionar células transducidas de forma estable. Las líneas celulares que expresan estos actuadores optogenéticos se transfectaron adicionalmente con dos plásmidos PiggyBac adicionales para expresar de manera estable ERK-KTR-mRuby2 con resistencia a higromicina y el marcador nuclear H2B-miRFP703 con resistencia a blasticidina. Para las células NIH3T3, los plásmidos PiggyBac se transfectaron utilizando el reactivo de transfección jetPEI. Para las células MCF10A, los plásmidos se transfectaron con el reactivo de transfección FuGENE HD (Sigma). Después de la transfección, las células se seleccionaron con antibióticos. Además, los NIH3T3 se clasificaron mediante FACS mientras que las células MCF10A se expandieron clonalmente para aumentar la homogeneidad de la expresión de los biosensores.

Sembramos 2 * 103 células NIH3T3/pocillo en una placa de 96 pocillos para los experimentos de imágenes y 1,5 * 106 células MCF10A/pocillo en una placa de 6 pocillos para la transferencia Western. En ambos casos, utilizamos placas ópticas de varios pocillos con fondo de vidrio recubiertas con 10 μg/ml de fibronectina durante una hora antes de la siembra. Las células permanecieron en ayunas durante 24 h antes del inicio del experimento.

Para todos los experimentos, los patrones de iluminación de LITOS se crearon en LibreOffice Calc. Para cargar los archivos csv, conectamos una computadora portátil al punto de acceso de LITOS y utilizamos la interfaz de usuario. Luego se colocó la placa de múltiples pocillos sobre la matriz de LED en la incubadora. Para garantizar la colocación adecuada de la placa de pozos, utilizamos una máscara de plexiglás hecha específicamente con una fresadora CNC (Figura complementaria S3c). Se permitió que las células se adaptaran durante al menos una hora a las condiciones de la incubadora antes de comenzar un experimento optogenético. Si lo permite el protocolo experimental, evitamos abrir la incubadora durante el experimento. Después de la estimulación, las células se fijaron añadiendo el mismo volumen de solución de paraformaldehído al 4% al volumen de medio presente en el pocillo. Para todos los experimentos mostrados, los diferentes puntos experimentales fueron estimulados en puntos de tiempo específicos que luego se fijaron simultáneamente al final del experimento. Después de 10 minutos de fijación, lavamos las células dos veces con PBS.

Las imágenes de microscopía de fluorescencia de campo amplio se adquirieron utilizando un microscopio Nikon Eclipse Ti equipado con Plan Apo Lambda 20 × (NA 0,75) y una cámara Andor Zyla 4.2+. Para la excitación, utilizamos las siguientes fuentes de luz LED: 555 nm para ERK-KTR y 640 nm para marcador nuclear). Para la estimulación de optoFGFR utilizamos una fuente de luz LED de 488 nm. El análisis de imágenes se realizó con una tubería establecida en nuestro laboratorio16. Primero, utilizamos el software Ilastik (versión 1.3.3) para crear un mapa de probabilidad de los núcleos utilizando el marcador nuclear H2B como imagen de entrada. Ilastik extrae características de píxeles mediante un banco de filtros y las clasifica mediante un algoritmo de bosque aleatorio. Luego realizamos la segmentación de instancias en CellProfiler (versión 3.0.0) y segmentamos el citosol en forma de anillo comenzando a 2 px de distancia del núcleo y con un ancho máximo de 5 px (Fig. 4b). La distancia de 2 px entre la segmentación del núcleo y el citosol garantiza que la imprecisión en la segmentación del núcleo no afecte los resultados. Después de medir la señal de ERK-KTR con esas dos máscaras de segmentación, calculamos la relación entre ERK-KTR presente en el citosol y en el núcleo (relación C/N). La fluorescencia citoplasmática relativa versus nuclear de la construcción KTR (relación C/N) se correlaciona con la actividad ERK y puede usarse como indicador de la actividad quinasa en células individuales.

Para la transferencia Western, las células se fijaron primero con paraformaldehído al 4% durante 10 minutos y luego se lisaron en tampón SDS al 2% (en TrisHCl, pH 6,8). La concentración de proteína se determinó con el kit de ensayo de proteínas Pierce BCA (Ref. 23227, Thermo Scientific). De cada lisado celular, se cargaron 10 µg de proteína en una página SDS (gel de fabricación propia al 10%) y luego se transfirieron a una membrana de transferencia Western de PVDF (Ref: 3010040001, Roche). La membrana se incubó con anticuerpo monoclonal de conejo contra ERK total (Ref: #4695) o anticuerpo monoclonal de conejo contra fosfo-ERK (Ref: #4370), ambos de Cell Signaling, y luego con Amersham ECL Rabbit IgG, Ab completo unido a HRP ( de burro, NA934VS), como anticuerpo secundario. Luego, la membrana se desarrolló utilizando reactivos de detección de transferencia Western Amersham ECL Prime (RPN2232) de GE Healthcare.

Los datos de una sola celda se representan con diagramas de caja o media con error estándar de la media, como se describe en la leyenda de la figura relativa. El análisis de datos y las figuras se crearon con R (versión 3.6.3, https://www.r-project.org/)30. Los datos correspondientes y los archivos R-notebook utilizados para el análisis de datos y la creación de imágenes se pueden encontrar en el material complementario.

Todos los conjuntos de datos, incluidos los cuadernos R utilizados para el análisis, se incluyen en la información complementaria.

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Este trabajo fue apoyado por la Subvención Div3 310030_185376 de la Fundación Nacional Suiza para la Ciencia a Olivier Pertz (Schweizerischer Nationalfonds zur Förderung der Wissenschaftlichen Forschung). Agradecemos al taller técnico del Departamento de Química, Bioquímica y Ciencias Farmacéuticas, al Centro de Imágenes Microscópicas (https://www.mic.unibe.ch) de la Universidad de Berna y a Tim Oliver Rod de la Academia de las Artes de Berna. (https://www.hkb.bfh.ch/en/) para obtener asistencia técnica.

Estos autores contribuyeron igualmente: Thomas Christoph Höhener y Alex Erich Landolt.

Instituto de Biología Celular, Universidad de Berna, 3012, Berna, Suiza

Thomas Christoph Höhener, Alex Erich Landolt, Coralie Dessauges, Lucien Hinderling, Paolo Armando Gagliardi y Olivier Pertz

Departamento de Ciencia e Ingeniería de Biosistemas, ETH Zurich, 4058, Basilea, Suiza

Alex Erich Landolt

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

TH concibió el diseño de placa optogenética. AL hizo el desarrollo de hardware y software. CD construyó el circuito genético que consta de optoFGFR, optoRaf y ERK-KTR. PAG produjo las líneas celulares MCF10A con optoFGFR, optoRaf y ERK-KTR. TH realizó y analizó los experimentos basados en células. TH, PAG y LH realizaron las mediciones del campo de iluminación. TH creó todas las figuras. LH creó el caso impreso en 3D. OP supervisó el trabajo. TH, PAG y OP escribieron el artículo. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Olivier Pertz.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Höhener, TC, Landolt, AE, Dessauges, C. et al. LITOS: una herramienta de iluminación LED versátil para estimulación optogenética. Representante científico 12, 13139 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-17312-x

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Recibido: 01 de marzo de 2022

Aceptado: 25 de julio de 2022

Publicado: 30 de julio de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-17312-x

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